真核生物異染色質是高度壓縮的染色質區域，富集了DNA/組蛋白甲基化等多種轉錄沉默型表觀修飾和特異的組蛋白變體等因子，對維持該區域的基因沉默和基因組穩定性起著至關重要的作用。染色質重塑蛋白可通過調節核小體上DNA和組蛋白八聚體之間的相互作用，移動、重排和重組染色質纖維，從而改變染色質的緊密程度和三維結構，影響基因的表達。R-loop是由RNA:DNA雜合鏈和單鏈DNA組成的三鏈核酸結構，在基因組上廣泛存在。孫前文實驗室前期的全基因組R-loop檢測發現大量低峰度的R-loop富集于擬南芥基因組的異染色質區域，但其相應的功能和生物學意義仍然未知。

(資料圖)

清華大學生命學院孫前文實驗室在《科學·進展》（Science Advances）雜志上發表了題為“DDM1介導的R-loop解除和H2A.Z排斥促進擬南芥異染色質的形成”（DDM1-mediated R-loop resolution and H2A.Z exclusion facilitates heterochromatinformation in Arabidopsis）的研究論文4，揭示了擬南芥中染色質重塑蛋白DDM1可通過解除R-loop結構并排除組蛋白變體H2A.Z來啟動異染色質形成的機制。該研究中，作者收集了眾多影響擬南芥異染色質狀態的突變體并進行了全基因組R-loop測序，結果發現染色質重塑蛋白DDM1的突變會引起著絲粒周圍區域異染色質R-loop水平顯著升高（圖1）。

圖1 DDM1突變導致著絲粒附近R-loop水平升高

DDM1是SWI/SNF家族蛋白的一員，早在1993年就發現其突變后會導致全基因組甲基化水平降低，但背后的機制仍然未知。通過ChIP-seq結果顯示DDM1富集在染色體的著絲粒周圍區域，而DDM1的突變會引起該區域的異染色質水平下降以及轉錄水平升高。有趣的是，轉錄抑制劑FLA可以顯著降低ddm1突變體中R-loop在著絲粒附近的富集，同時部分回補DNA甲基化在ddm1中的缺失（圖2）。這些結果說明，DDM1可抑制與轉錄耦聯的R-loop異常積累，從而確保著絲粒附近的DNA甲基化等異染色質狀態正常建立。

圖2轉錄耦聯R-loop破壞著絲粒附近異染色質

DDM1的N端和C端都有保守的解旋酶結構域（圖3A）,并且擬南芥ddm1-1突變體在C端解旋酶保守結構域中發生了C615Y的氨基酸殘基突變。體外結果顯示，RNA:DNA雜合鏈可以顯著激活DDM1蛋白的ATPase活性，并且體外重組的DDM1蛋白可以RNA從RNA:DNA雜合鏈結構中解離，但是突變體蛋白DDM1C615Y的解旋酶活性顯著下降（圖3）。結合in vivo數據，表明DDM1可以直接清除在異染色質區域瞬時轉錄產生的R-loop結構，并促進異染色質形成。

圖3 DDM1解除RNA:DNA雜合鏈

為了深入探索DDM1促進異染色質形成的機制，作者通過結合免疫沉淀-質譜分析尋找DDM1的互作蛋白。結果顯示，DDM1可以和多種H2A組蛋白變體互作，其中H2A.W與H2A.Z兩種變體在基因組上的分布是互斥的（圖4A和B）。ChIP-seq結果顯示，DDM1功能缺失的突變體中，著絲粒區域的H2A.W含量下降，而H2A.Z含量上升（圖4C），說明野生型中異染色質區域定位的DDM1阻止了H2A.Z在該區域富集。體外互作結果表明，DDM1可以分別與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B二聚體互作（圖4D），但是H2A.W-H2B可以抑制DDM1與H2A.Z-H2B復合物的形成（圖4E），這也解釋了在野生型中DDM1可以幫助H2A.W定位在著絲粒周圍區域、同時抑制H2A.Z在該區域的富集這一現象。有趣的是，DDM1與H2A.W-H2B、H2A.Z-H2B均可抑制DDM1的解旋酶活性（圖4F），而H2A.W的三突變體h2a.w-3中R-loop水平并沒有顯著升高（圖4C），表明DDM1解除R-loop和調控H2A變體定位的這兩種功能相互獨立。

圖4 DDM1抑制H2A.Z在著絲粒附近富集

由于H2A.Z在染色體上的定位由SWR1復合物介導，作者在ddm1背景下對擬南芥SWR1復合物的關鍵因子ARP6進行敲除，發現ddm1arp6雙突可以一定程度上降低H2A.Z的積累，同時回補ddm1升高的R-loop和降低的DNA甲基化水平（圖5）。這些結果說明，DDM1可以抑制H2A.Z在著絲粒周圍區域的積累，同時解除由H2A.Z富集帶來的轉錄耦聯R-loop，從而促進異染色質的形成。

圖5抑制H2A.Z的富集可回補ddm1中R-loop的異常積累和DNA甲基化缺失

最后，作者發現DDM1抑制H2A.Z、解除R-loop的功能與花粉核的形態密切相關。野生型的花粉中，DDM1在精核（SN, sperm nuclei）中富集，而H2A.W也在精核中積累，但H2A.Z和R-loop在營養核（VN, vegetative cell nuclei）中富集（圖6A-C）。DDM1功能缺失后，H2A.Z和R-loop信號可以擴散到精核中（圖6B和C），但H2A.W在精核中的聚集狀態沒有發生改變（圖6A）。同時，ddm1突變體中異常富集的H2A.Z與R-loop伴隨著花粉精核變大、空洞的形成（圖6D）。

圖6 DDM1在精核中解除R-loop和抑制H2A.Z富集

綜上所述，本項研究揭示了擬南芥的一種染色質重塑蛋白DDM1的主要功能是排斥異染色質區域的H2A.Z積累并解除R-loop，從而啟動異染色質的形成，闡明DDM1維持基因組DNA甲基化的分子新機制和生物學新功能。

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